550万个灰枣接穗的品种纯度进行鉴定

新疆农林业司法鉴定所司法鉴定检验报告书

新农林检字[2008]第0321号

一、基本情况

委托单位：新和县塔木托格拉克乡人民政府

委托鉴定事项：对新和县塔木托格拉克乡所采购的550万个灰枣接穗的品种纯度进行鉴定。

受理日期：2008年3月21日

鉴定材料：枣树接穗

鉴定日期：2008年3月21日

鉴定地点：新和县新疆惠华食品有限公司6号冷库

在场人员：朱永刚、刘国权、阿地力阿吾提、海仁沙，张长江、任生理。

二、检案摘要

新和县塔木托格拉克乡人民政府采购了550万个灰枣接穗，为查清该批灰枣接穗的纯度，特委托我所对550万个灰枣接穗的品种纯度进行鉴定。

三、检验过程

我所接受委托后，于2008年3月21日指派鉴定人员张长江、任生理二人组成鉴定组，到达新和县新疆惠华食品有限公司6号冷库，提取了枣树接穗样品：

（一）、所取样品的抽样基数为550万个灰枣接穗（分装在522个塑料袋内）。

（二）、检验方法及过程：

1、DNA模板的制备

提取程序参照Paterson所述的CTAB法。

（1）取3g接穗枝皮，在液氮冷冻下迅速研磨成粉末，放入50mL离心管中，加入15mL裂解缓冲液（65℃），混匀，65℃水浴30～60mim

（2）水浴后加入等体积的氯仿－异戊醇（24：1），16℃，5000r／min，离心10min。

（3）吸取上清液加入等体积氯仿－异戊醇（24：1），4℃，5000r／min，离心10min。

（4）吸取上清液加入0.6倍体积的冰冻异戊醇，沉淀DNA。

（5）DNA用70％乙醇侵洗2～3次。室温干燥后，容于700μL 1×TE中。

（6）加入15μLRNaseA，37℃水浴保温1h。

（7）加入等体积的酚－氯仿溶液，10000r／min 4℃ 离心10min。

（8）吸取上清液加等体积的氯仿－异戊醇（24：1），10000r／min 4℃ 离心10min。

（9）吸取上清液加等体积的水饱和乙醚和1／3体积的5M NaCl，10000r／min 4℃ 离心10min。

（10）吸取上清液，加入1／10体积3M醋酸钠，2倍体积的无水乙醇。静止2～5min，挑DNA，风干，加100μL 1×TE溶解。-20℃下保存备用。

（12）用紫外分光光度计测定DNA样品的质量和浓度。根据测定数值，稀释DNA至试验需要浓度。

2 AFLP扩增与产物检测（以下过程均在德国Biometra公司生产的T Gradient PCR仪中进行）

2.1 AFLP扩增体系及扩增程序

（1）模板DNA的酶切体系及条件

成分                                          体积

DNA（150ng／μL）                              3μL

H2O                                           14.3μL

10×NEB Buffer                                2μL

100×BSA                                      0.2μL

Mse I（15U／μL）                              0.2μL

EcoR I（10／μL）                              0.3μL

总体积20μL／管

酶切温度37℃，时间3h。

（2）酶切DNA片断的连接体系及条件

DNA在酶切后加入以下成分，总体积30μL／管。37℃下过夜，连接结束后65℃变性10min。

成分                                          体积

H2O                                            2.7μL

10×T4 Buffer                                  3μL

EcoR I接头（5p mole／μL）                     1.0μL

Mse I接头（50p mole／μL）                     1.0μL

10mM ATP                                       1.8μL

T4-DNA连接酶（3U／μL）                        0.5μL

（3）连接产物的预扩增体系和扩增程序

将连接产物用0.1×TE稀释10倍用于预扩增。

成分                                          体积

连接稀释DNA                                   5μL

H2O                                            10.1μL

10×PCR Buffer                                 2μL

2.5mM dNTP                                     1.6μL

Mse I引物（M00，50ng／μL）                    0.6μL

EcoR I引物（M00，50ng／μL）                   0.6μL

Taq酶（5U／μL）                               0.1μL

矿物油                                         8μL

预扩增程序：

Step1                     95℃                  2min

Step2                     95℃                  30s

Step3                     56℃                  30s

Step4                     72℃                  60s

Step5                  GO TO Step2              30 cycle

Step6                     72℃                  10min

Step7                     10℃                  10h

（4）DNA片断的选择扩增和扩增程序

将预扩增产物用0.1×TE稀释10倍用于预扩增。

成分                                          体积

预扩稀释DNA                                   5μL

H2O                                            9.85μL

10×PCR Buffer                                 2μL

2.5mM dNTP                                     1.8μL

Mse I引物（50ng／μL）                         0.6μL

EcoR I引物（50ng／μL）                        0.6μL

Taq酶（5U／μL）                               0.15μL

矿物油                                         8μL

选择扩增程序：

Step1                     95℃                  2min

Step2                     95℃                  50s

Step3                     65℃                  40s（每循环降低1℃）

Step4                     72℃                  60s

Step5                  GO TO Step2              13 cycle

Step6                     95℃                  50s

Step7                     56℃                  40s

Step8                     72℃                  60s

Step9                  GO TO Step6              31 cycle

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